La metodica del comet assay è un metodo rapido e sensibile di microscopia a fluorescenza per esaminare i danni del DNA a livello cellulare. La tecnica si basa sulla semina di cellule ed agarosio su un comune vetrino da microscopia ottica. Successivamente, dopo aver lisato le proteine presenti nel citoplasma nel nucleo si effettua una corsa elettroforetica in tampone alcalino. Il gel d'agarosio costituisce un settaccio molecolare aperto in cui le maglie hanno un'ampiezza sufficiente per permettere il passaggio, attraverso la soluzione tampone contenuta nell'apparecchio elettroforetico, delle molecole di DNA. Poiché la velocità di migrazione dipende dalle dimensioni della molecola, si osserva che le molecole ad alto peso molecolare migrano più lentamente di quelle di più piccole dimensioni essendo maggiore la resistenza che incontrano nell'attraversare il gel. Nel caso in cui il DNA cellulare sia integro, a causa dell'alto peso molecolare, non si assisterà alla migrazione dello stesso all'interno del gel, al contrario, se all'interno dei filamenti di DNA sono presenti vari tipi di rottura, tali frammenti migreranno quando sottoposti al campo elettrico. Tale migrazione porta alla formazione di una cometa la cui testa risulta
costituita dalle porzioni di DNA più grandi, mentre la coda risulta formata dai frammenti più piccoli. La lunghezza della coda della "cometa" risulta quindi direttamente proporzionale al numero dei punti di rottura all'interno del DNA stesso. Colorando i vetrini con un colorante specifico per il DNA, mediante microscopio a fluorescenza, è possibile valutare le comete prodotte da 150 cellule per ogni soggetto e, tramite il software di cui siamo dotati analizzare i seguenti parametri: taillength, ovvero la distanza tra la testa della cometa e l'ultimo frammento di DNA, tail migration ovvero percentuale di DNA migrato dalla testa della cometa, tail moment
ovvero percentuale di DNA per taillength, tail intensità. In sintesi quello che ci proponiamo di valutare mediante l'applicazione di tale metodica è il danno cellulare indotto dalla polichemioterapia nei pazienti affetti da tumori e il danno cellulare presente nei pz con sindrome di Down conseguente all'anomalo funzionamento del sistema ossido-riduttivo di questi soggetti. Relativamente al gruppo dei pz oncologici abbiamo incluso nello studio tutti i pazienti con età compresa :tra O e 18 anni, di entrambi i sessi affetti da neoplasia, sono stati esclusi tutti i portatori di anomalie cromosomiche e quelli pretrattati. I pazienti inclusi nello studio vengono monitorati mediante prelievo di 5 cc di sangue (in eparina) a tempo O ( esordio di malattia), 1 (metà ciclo terapeutico), 2 (termine della terapia), 3 (follow up). I protocolli terapeutici previsti in tali patologie prevedono una durata media che va da sei mesi ad un anno. Sono stati reclutati IO bambini, 4 sono deceduti, per tanto in questo studio pilota sono stati reclutati 6 bambini affetti da tumori solidi ( quatro tumori SNC, 1 osteosarcoma, 1 istiocitosi). Dei 6 pazienti due sono stati sottoposti chemioterapia a basse dosi ( carcinoma dei plessi corioidei, istiocitosi a cellule di Langherans), negli altri casi il trattamento è stato intensivo (osteosarcoma,astrogliobalstoma anaplastico di gradi ilI)
e, in un caso associato a radioterapia (ependimoma). I trattamenti più blandi
sembrano non causare un danno irreversibile del DNA mentre i trattamenti più aggrssivi sembrano aver determinato un danno più difficilmente ripristinabile in stop therapy e in foll ow up . Relativamente al gruppo dei bambini Down, è stato effettuato uno studio in doppio cieco, dei 37 bambini Down reclutati (14 maschi, 23 femmine con trisomia classica di età compresa :fra 4 e 12 anni), 19 hanno assunto per sei mesi
1 antiossidante (coenzima Q al dosaggio di 4mg/Kgldose), gli altri 18 un placebo.Campioni di sangue sono stati presi a tempo O e, risPettivamente, dopo 1,3 e 6 mesi. Risultati preliminari evidenziano un aumentato danno del DNA sia nel numero di cellule sia quantitativo per ogni cellula, la supplementazione con antiossidante per os non è in grado di ridurre il danno del DNA nelle cellule già compromesse, ma potrebbe avere un molo protettivo verso le cellule con livello di danno medio basso.
