Chromosomal study of native and hatchery trouts from Italy (Salmo trutta complex, Salmonidae): conventional and FISH analysis

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Oggetto del lavoro (traduzione)

Nel presente lavoro sono riportati i risultati di un'analisi citogenetica eseguita su popolazioni italiane di trota fario (Salmo trutta complex) utilizzando colorazioni convenzionali, tecniche di bandeggio e ibridazione in situ (FISH) con sonde fluorescenti. Tutti gli individui esaminati, appartenenti alle linee evolutive Atlantica (At), Marmoratus (Ma), Adriatica (Ad) e Mediterranea, hanno mostrato una considerevole stabilità cromosomica, con un complemento diploide pari a 2n = 80 cromosomi, numero fondamentale pari a 102 e una sostanziale uniformità morfologica delle varie coppie di omologhi. Tale uniformità ha riguardato anche la localizzazione del DNA ribosomiale 5S e dei siti NOR attivi. Al contrario, la FISH con una sonda di DNA ribosomiale 28S e la colorazione col fluorocromo CMA₃ ha mostrato che i

siti NOR inattivi sono più numerosi nelle linee evolutive Ad e Me rispetto alle linee At e Ma. Poiché le sequenze centromeriche sono altamante conservate nei Salmonidi, si è deciso di isolare un DNA satellite centromerico a partire da una sequenza nota (satellite HpaI) di Salmo salar. Dal prodotto di PCR si è estratto il DNA corrispondente al dimero, che è stato clonato sequenziato e ibridato in situ sui cromosomi metafisici di individui appartenenti a quattro linee evolutive del complesso di Salmo trutta. La sequenza risulta caratterizzata da un elevato contenuto in AT (65,3%) e da un breve motivo di consenso (A/T)(G/C)AAA(T/C) simile a quello presente in altri DNA satellite, mentre l'ibridazione in situ ha evidenziato dei pattern linea evolutiva-specifici. Poiché è ben noto che sequenze ricche in AT possono indurre una marcata curvatura del DNA che, a sua volta, promuove una più rapida e compatta spiralizzazione dell'eterocromatina, è possibile ipotizzare che l'ampia diffusione di questo satellite in S. trutta abbia giocato un ruolo nel determinarne la stabilità cariotipica. La presenza di questo satellite in altre specie di Salmonidi è stata verificata tramite Southern blot e utilizzata per analizzare la sua diffusione entro questo gruppo di Teleostei. In definitiva, i risultati di questo studio hanno fornito utili marcatori per la caratterizzazione citogenetica di alcune linee evolutive appartenenti al S. trutta complex. Le differenze cromosomiche osservate sembrano però troppo deboli per rappresentare un'efficace barriera post-zigotica al flusso genico fra popolazioni di trota che hanno cominciato a divergere all'inizio del Pleistocene. Infatti, anche una linea evolutiva altamente divergente come S. marmoratus non sembra mostrare alcuna restrizione all'ibridazione con altri ceppi genetici di S. trutta, soprattutto in quei casi in cui l'uomo ha forzato le naturali barriere ecologiche con erronee pratiche gestionali.

Job task

A cytogenetic analysis was carried out using conventional staining, banding techniques and fluorescence in situ hybridization (FISH) in Italian populations of brown trout (Salmo trutta complex). All individuals analysed, belonging to the Atlantic (At), Marmoratus (Ma), Adriatic (Ad) and Mediterranean (Me) lineages, showed remarkable karyotype uniformity, with diploid complement of 2n = 80 chromosomes, arm number (NF) of 102 and invariable composition of karyotype. Such uniformity was observed also with respect to the location of 5S rDNA and the active, i.e. silver-positive NOR sites. On the contrary, FISH with 28S ribosomal probe and fluorescent staining with CMA₃ revealed that inactive NOR sites are more numerous in Ad and Me than in At and Ma lineages. A centromeric sequence was successfully isolated from Salmo trutta individuals by polymerase chain reaction (PCR)-based cloning, using primers designed from published Atlantic salmon (Salmo salar) satellite DNA sequences. This sequence had high AT content (65.3%) and short consensus motif (A/T)(G/C)AAA(T/C) similar to other centromeric satellite repeats. The isolated satellite DNA clones were localized with FISH in the centromeric regions of the brown trout chromosomes, showing lineage-specific patterns. Because it is well known that AT-rich sequences can induce a pronounced DNA curvature, which in turn would promote faster and higher chromatin spiralization, it may be hypothesised that the wide distribution of this satellite in S. trutta genome may have played a role in its karyotype stability. The presence of this sequence in other salmonid species was also tested by Southern blot hybridization and used to analyze its evolution within salmonids. In conclusion, the results of this study provided useful markers for the cytogenetic characterisation of some evolutionary lineages belonging of the S. trutta complex. Nevertheless, the chromosomal differences observed seem to be too weak to represent an effective post-zygotic barrier to gene flow between populations that started to diverge at the beginning of Pleistocene. In fact, even highly diverged lineage such as S. marmoratus does not seems to show any restriction to gene flow to and from genomes of other S. trutta lineages, especially where man forced the natural eco-ethologic barriers with erroneous stocking practice.

Referente:

Prof. Vincenzo Caputo, Dipartimento di Biochimica, Biologia e Genetica

E-mail: v.caputo@univpm.it